2022年5月20日，beat365IDG麥戈文腦科學研究所、beat365、北大-清華生命科學聯合中心王征課題組，在《eLife》在線發表題為“Mapping brain-wide excitatory projectome of primate prefrontal cortex at submicron resolution and comparison with diffusion tractography”的研究論文，報道了團隊在猕猴大腦建立細胞類型特異的病毒标記方法，結合雙光子成像成功構建了猕猴腹外側前額葉（ventrolateral prefrontal cortex, vlPFC）的興奮性軸突全腦三維投射圖譜，并與在11.7T超高場磁共振上獲得的猕猴全腦神經纖維連接圖譜進行比較，發現猕猴前額葉與枕葉之間不存在直接的、單突觸神經纖維連接通路。

神經環路的結構解析是理解大腦高級功能的基礎，可為腦疾病的診斷和治療提供精确的标記和幹預靶點，亦可為類腦智能技術提供創新架構和技術模拟的連接基礎。介觀層面重建模式動物大腦的神經環路已被科技創新2030—“腦科學與類腦研究”重大項目列為重要研究方向。自2015年起，王征課題組與中科院徐富強團隊緊密合作，在猕猴大腦測試了多種病毒載體包括腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）、水泡口咽病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）和慢病毒（lentivirus），發現AAV病毒更适合在猕腦上開展長程軸突示蹤标記（圖1 所示）。傳統的組織切片光學成像往往伴随嚴重的組織形變，難以實現大範圍的三維重建。近年來蓬勃發展的大尺度三維介觀光學成像比如華中科技大學駱清銘和龔輝教授團隊研創的MOST技術，都具有高通量自動化的特性，突破傳統技術瓶頸，已經在齧齒類動物上完美實現了全腦介觀成像。

圖1 猴腦腹外側前額葉AAV病毒标記示蹤神經軸突投射

猕猴腹外側前額葉腦區參與靈活決策、工作記憶等多種高級認知功能。王征實驗室此前在轉基因猕猴模型和臨床患者上的研究成果揭示了腹外側前額葉的異常與認知靈活性損傷密切相關（J Neurosci, 2020; Am J Psychiatry, 2021），并且發現腹外側前額葉的結構與功能網絡特征可用于指導改善臨床病人抑郁、焦慮症狀的治療方案（J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2021; Mol Psychiatry, 2022）。因此，深入完整地解析腹外側前額葉的神經纖維連接圖譜對全面解析其在腦認知和腦疾病中所扮演的角色至關重要。本研究在猕猴腹外側前額葉注射（AAV2/9）為載體攜帶興奮性啟動子CaMKIIα及融合報告基因Tau-GFP來選擇性标記興奮性軸突，采用連續光學成像構建了0.95×0.95×200μm空間分辨率的全腦神經纖維投射圖譜（圖2A），發現興奮性軸突主要連接在前額葉内部不同區域，同時投射到颞葉、邊緣系統、腦島、頂葉和部分皮下核團。

擴散磁共振成像（diffusion MRI）主要利用水分子微觀擴散的各向異性特征建模，以此推斷神經纖維束的空間走向，重建全腦結構連接圖譜（tractography），已廣泛應用于動物和人體，是目前唯一的神經纖維活體示蹤技術。但因其精确性和可靠性亟需驗證，所重建的大腦神經連接圖譜引發了諸多争議（Science，2012），也限制了該技術在臨床中的推廣應用。王征課題組對11.7T超高場磁共振成像系統的軟件序列和離體猴腦的成像方法進行優化後，可獲得高達200×200×200μm的擴散磁共振影像數據，将其與病毒标記軸突熒光圖像數據配準到标準猴腦空間（圖2B，Cereb Cortex, 2021），以病毒标記注射的位點作為種子區域進行神經纖維追蹤（圖2C），随後在同一個空間比較兩種不同模态、尺度的影像數據（圖2D）。結果發現兩種成像模态所得到的神經纖維投射具有較高的相關系數（皮爾遜相關系數為0.4624 ± 0.0922; Dice相關系數為0.4312 ± 0.0861），這為驗證擴散磁共振成像技術提供了新的實驗數據，同時也為橋接宏觀與介觀影像數據空間建立了可行的技術方法。

圖2 構建猕猴腹外側前額葉全腦介觀與宏觀連接圖譜的主要流程

下額枕束（inferior fronto-occipital fasciculus, IFOF）是一條從額葉如腹外側前額葉、眶額葉等區域出發，經外囊到達枕葉的神經纖維束。早在1909年哈佛大學醫學院解剖學助理Curran解剖人腦白質纖維時就已發現（J Comp Neurol Psychology, 1909），但猕猴大腦的下額枕束是否存在始終沒有定論。研究團隊先利用擴散磁共振成像數據重建了下額枕束的投射路徑，然後與病毒标記的熒光圖像數據相比，發現腹外側前額葉發出的興奮性軸突隻在前半腦與下額枕束存在較大的重合，随後大部終止于颞上回區域，但下額枕束則繼續投射到枕葉部分（圖2）。此結果揭示猕猴腹外側前額葉與枕葉之間不存在直接的、單突觸神經纖維連接，利用擴散磁共振成像技術觀測到的下額枕束可能是一條間接、跨突觸的神經通路，為解析領域内的重大争議問題提供了新的實驗證據。此外，本研究也為開展猕猴介觀神經連接圖譜研究開辟了一條新路徑。

圖3 猕猴大腦下額枕束IFOF的比較：11.7T超高場磁共振成像與病毒示蹤标記

中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）鄢明超博士和複旦大學類腦智能科學與技術研究院俞文文為該論文共同第一作者，王征研究員為唯一通訊作者。11.7T超高場磁共振影像數據在複旦大學張江國際腦影像中心完成采集，期間得到了王鶴青年研究員、張孝勇青年研究員的大力支持和幫助。本課題同時與浙江工業大學馮遠靜教授團隊、中國科學院深圳先進技術研究院徐富強研究員緊密合作，得到了科技部科技創新2030-“腦科學與類腦研究”，國家自然科學基金委，中國科學院，上海市，廣東省及北大-清華生命科學聯合中心的資助。本項目所有猕猴的腦影像數據可完全自由共享給感興趣的同行研究者。

原文鍊接： https://doi.org/10.7554/eLife.72534

2022-05-21